問題狀態(tài)
HPLC原理就是利用固定相與流動相的極性的差異,而達(dá)到分散物質(zhì)目的。
(一)有效液相色譜闡發(fā)的流程
由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng),然后輸出,經(jīng)流量與壓力測量之后,導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入,并隨流動相通過色譜柱,在柱上進(jìn)行分散后進(jìn)入檢測器,檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備收羅與處理,并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分散(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜轉(zhuǎn)變溫度,
而HPLC轉(zhuǎn)變的是流動相極性,使樣品各組分在***佳條件下患上以分散。
有效液相色譜法按分散機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及份子排阻色譜法。
1.液固色譜法 使用固體吸附劑,被分散組分在色譜柱上分散原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分散。分散過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分散份子量200~1000的組分,大多數(shù)用于非離子型化合物,離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分散同分異構(gòu)體。
2.液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面,或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相,分散原理是根據(jù)被分散的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分散。分散過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定響應(yīng)具有杰出的惰性;流動相須***預(yù)先用固定相飽和,以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分散和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,現(xiàn)在已很少接納?，F(xiàn)在多接納的是化學(xué)鍵合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 接納極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分散中常極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、***類、羰基類及氨基酸類等)。
反相色譜法 一般用非極性固定相(如C18、C8);流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分散非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用***為廣泛,據(jù)統(tǒng)計,它占全般HPLC應(yīng)用的80%擺布。
跟著柱填料的快速成長,反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大,現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的闡發(fā)。為控制樣品在闡發(fā)過程的解離,常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會使硅膠溶解,太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
從上表可看出,當(dāng)極性為中常時正相色譜法與反相色譜法沒有較著的界線(如氨基鍵合固定相)。
3.離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架,在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分散組分在色譜柱上分散原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換,根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷魔力而分散。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分散組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分散子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外,它還受流動相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可轉(zhuǎn)變化合物的解離程度,繼續(xù)往前影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大,則離子強(qiáng)度高,不利于樣品的解離,導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于闡發(fā)有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.離子對色譜法 又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分散子與離子對試藥離子形成中性的離子對化合物后,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分散效果改善。主要用于闡發(fā)離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。
闡發(fā)堿性物質(zhì)常用的離子對試藥為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。
闡發(fā)酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的離子對試藥,在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分散。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。
5.排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動相是可以溶解樣品的溶劑。小份子量的化合物可以進(jìn)入孔中,滯留時間長;大份子量的化合物不能進(jìn)入孔中,直接隨流動相流出。它利用份子篩對份子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分散。常用于分散高份子化合物,如社團(tuán)提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
正相色譜法
反相色譜法
固定相極性
高～中
中～低
流動相極性
低～中
中～高
組分洗脫次序
極性小先洗出
極性大先洗出
有效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上,引用了氣相色譜的理論,在技能上,流動相改為高壓運(yùn)送(***高運(yùn)送壓力可達(dá)4.9′107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器,可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。
特點
1.高壓:液相色譜法以液體為流動相(稱為載液),液體流經(jīng)色譜柱,受到阻力較大,為了迅速地通過色譜柱,須***對載液施加高壓。一般可達(dá)150～350×105Pa。
2. 高速:流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快患上多,一般可達(dá)1～10ml/min。有效液相色譜法所需的闡發(fā)時間較之經(jīng)典液相色譜法少患上多,一般少于 1h 。
3. 有效:近來研究出很多新型固定相,使分散效率大大提高。
4.高靈敏度:有效液相色譜已廣泛接納高靈敏度的檢測器,進(jìn)一步提高了闡發(fā)的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達(dá)10-11g。另外,用樣量小,一般幾個微升。
5.順應(yīng)范圍寬:氣相色譜法與有效液相色譜法的比較:氣相色譜法雖具有分散能力好,靈敏度高,闡發(fā)速度快,操作方便等優(yōu)點,但是受技能條件的限制,沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行闡發(fā)。而有效液相色譜法,只要求試樣能制成溶液,而不需要氣化,因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對份子量大(大于 400 以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總額的 75% ～ 80% )原則上都可應(yīng)用有效液相色譜法來進(jìn)行分散、闡發(fā)。 據(jù)統(tǒng)計,在已知化合物中,能用氣相色譜闡發(fā)的約占20%,而能用液相色譜闡發(fā)的約占70～80%。
有效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為有效凝膠色譜、疏水性有效液相色譜、反相有效液相色譜、有效離子交換液相色譜、有效親和液相色譜以及有效會聚液相色譜等類型。用不******型的有效液相色譜分散或闡發(fā)各類化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是有效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、反復(fù)性好,
有效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、.分散系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將別離敘述其各自的組成與特點。
1.進(jìn)樣系統(tǒng)
一般接納隔閡注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的。這對提高闡發(fā)樣品的反復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4X107Pa,流速可調(diào)且穩(wěn)定,當(dāng)高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),可加速其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、連結(jié)樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而轉(zhuǎn)變,包括轉(zhuǎn)變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各類物質(zhì)(即使僅有一個基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲患上有用分散。
3.分散系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2～5mm,由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁試管或鈦合金等材料制成,住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點,加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或用化學(xué)法偶聯(lián)各類基因(如磷酸基、季***基、羥甲基、苯基、氨基或各類長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此,這種固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有杰出的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分散出來。
另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論闡發(fā),基質(zhì)粒度小,塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證實基質(zhì)粒度小,會提高分辨率的道理。
再者,有效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,通過改善傳質(zhì)速度,縮短闡發(fā)時間,就可增加層析柱的效率。
4.檢測系統(tǒng)
有效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點:使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml);線性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。目前,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不舒服用于痕量闡發(fā),也不舒服用于梯度洗脫樣品的檢測。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、***類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定,其靈敏度很高(檢測下限為10-12～10-14g/ml),痕量闡發(fā)和梯度洗脫作品的檢測均可接納。
(5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行收羅、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分散、制備或鑒定工作能正確開展。
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